熒光定量PCR（qPCR）是對核酸序列檢測和定量的精 準(zhǔn)方法，該方法需要熒光定量儀器，以及作為擴增熒光示蹤的雙鏈嵌合染料（例如：SYBR? Green I）和熒光修飾探針（例如：TaqMan 探針”）。

qPCR和RT-qPCR現(xiàn)已廣泛用于基因表達(dá)研究、SNP分型、雜質(zhì)篩查、傳染病和癌癥的分子診斷等。在這些應(yīng)用中，高通量的qPCR實驗?zāi)軌驇砭薮蟮膬?yōu)勢，例如：在基因表達(dá)研究中可以同時監(jiān)測更多的靶標(biāo)、對照、重復(fù)組；在篩查試驗中可做到更大規(guī)模，在分子診斷中可支持更多病人樣本。在96孔板基礎(chǔ)上，支持 384孔板的qPCR儀器有效提高了檢測通量，然而手動加樣建立反應(yīng)體系，會帶來很多不確定因素（例如：加樣體積誤差、漏加、錯加等），并會耗費較長時間的人力。自動化移液系統(tǒng)可有效改善這些問題，提高效率，突破手動操作在整個流程中的瓶頸。

我們在研究中證實，NEB Luna系列qPCR試劑在高通量應(yīng)用中表現(xiàn)卓 越，并與自動上樣設(shè)備“貝克曼庫爾特公司的Echo525聲波移液系統(tǒng)”兼容。該儀器是以非接觸移液方式進(jìn)行小體積移液的設(shè)備，專為生命科學(xué)和基因組學(xué)而設(shè)計。使用聲波完成移液是通過聲波液滴噴射技術(shù)（ADE）實現(xiàn)，它將聲波聚焦形成固定體積的小液滴（Echo525的液滴為25nL）從母板孔中轉(zhuǎn)移到目標(biāo)位置。這一技術(shù)實現(xiàn)了移液體積從納升到微升的范圍內(nèi)，精確、快速的轉(zhuǎn)移液體，同時避免傳統(tǒng)槍頭移液方式帶來的交叉污染，并減少耗材和試劑的使用。

NEB Luna 系列 qPCR & RT-qPCR 試劑

Beckman Coulter Echo 525聲波移液系統(tǒng)

Echo 525非常適合高通量qPCR體系建立，可以在10分鐘內(nèi)完成384孔板qPCR體系建立，并確保后續(xù)的qPCR實驗檢測靈敏、定量準(zhǔn)確，并可減少反應(yīng)體積。此外，使用 Luna Cell Ready One-Step RT-qPCR試劑盒，我們?yōu)榧?xì)胞樣本的自動化直接 RT-qPCR 分析提供了一個方便的工作流程，在Echo校準(zhǔn)母板中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)和裂解，提供可用于轉(zhuǎn)移的模板裂解物ADE 介導(dǎo)的反應(yīng)組裝和高通量RT-qPCR分析。

NEB Luna 試劑與貝克曼庫爾特聲波移液系統(tǒng)和微量反應(yīng)體系兼容

使用 Beckman?Echo 525聲波移液系統(tǒng)，在384孔板中建立10μl、5μl和2μl的Luna通用一步法RT-qPCR 反應(yīng)體系，對7-log濃度梯度的人源GAPDH進(jìn)行定量（25ng/μl–25fg/μl Jurkat總RNA），每個濃度重復(fù)8次。結(jié)果顯示：在微量反應(yīng)體系中，依然展現(xiàn)出良好的線性定量能力和低起始量檢測。

Luna Cell Ready一步法RT-qPCR實驗流程

Luna Cell Ready一步法RT-qPCR試劑盒提供了直接從細(xì)胞（50μl體系可裂解高達(dá)10萬個細(xì)胞）到RNA檢測和定量的所有組分。Luna Cell Ready裂解模塊整合了DNase I和Luna Cell Ready蛋白酶的功能，僅需15分鐘即可完成細(xì)胞裂解、RNA 釋放和基因組DNA去除。2μl裂解產(chǎn)物（相當(dāng)于0.2–4000個細(xì)胞中的RNA）即可實現(xiàn)20μl體系的RT-qPCR反應(yīng)。

從Echo校準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)母板到免提取一步法RT-qPCR檢測的完整解決方案

A. 將A549（人肺癌）細(xì)胞以每孔1000個細(xì)胞接種到384孔Echo校準(zhǔn)母板中，培養(yǎng)過夜，并使用 Luna Cell Ready裂解模塊(NEB #E3032)室溫條件下裂解10 分鐘。

B. 然后將裂解產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)移到Echo建立的Luna通用一步法RT-qPCR反應(yīng)體系中。

C. 檢測24個靶基因的相對表達(dá)，每個靶標(biāo)有6個樣品重復(fù)（細(xì)胞培養(yǎng)源板孔）和2個技術(shù)重復(fù)，總共 288 個反應(yīng)。點表示重復(fù)（每個靶基因 12 個）；線和數(shù)據(jù)標(biāo)簽表示靶基因與肌動蛋白（底部）相比的ΔCq。

D. 在類似的實驗中，使用 Luna Cell Ready探針一步法RT-qPCR試劑盒(NEB #E3031) 使用探針法熒光定量檢測了另外19個靶基因的相對表達(dá)。