來源：醫(yī)麥客

作者：細(xì)胞市場部

CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)一經(jīng)誕生就被視為21世紀(jì)最為重要的生物發(fā)現(xiàn)之一。由于其穩(wěn)定高效，CRISPR/Cas9技術(shù)已經(jīng)成為科研界和工業(yè)界實現(xiàn)基因組編輯的強(qiáng)大工具，而基因修飾細(xì)胞的同質(zhì)性是細(xì)胞系開發(fā)、基因治療和組織工程，尤其是再生醫(yī)學(xué)等許多應(yīng)用的必要條件。細(xì)胞篩選和驗證過程仍是當(dāng)今克隆工作流程中不可或缺的一部分，但其缺乏有效分離和表征工程改造細(xì)胞的工具被認(rèn)為是這些應(yīng)用中的一個重要瓶頸。

大多數(shù)基因工程方法，以CRISPR/Cas9為例，細(xì)胞通過非同源末端連接進(jìn)行修復(fù)，這個容易出錯的過程，通常會導(dǎo)致脫靶、單等位基因修飾和未編輯等非同質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生。因此，在使用前，必須對細(xì)胞進(jìn)行分離并克隆鑒定，確保其克隆性和譜系可追溯性，這不僅對制藥、細(xì)胞治療等非常重要，也是EMA和FDA監(jiān)管要求所強(qiáng)制執(zhí)行的。另外，基因組上正確的修飾不能確保預(yù)期的基因表達(dá)變化，因此需求驗證必須要對基因組、mRNA表達(dá)和蛋白質(zhì)水平上進(jìn)行高內(nèi)涵表征。

最近，Tobias Gross等人提出了一個改進(jìn)且更并行的工作流程，解決了傳統(tǒng)細(xì)胞擴(kuò)增昂貴、易失敗且耗時等問題，還提供了低細(xì)胞分析。無需過多的克隆擴(kuò)增，即可收獲滿足質(zhì)量要求的具有深度表征的單細(xì)胞克隆。

以最小克隆擴(kuò)增建立和表征CRISPR/Cas9編輯細(xì)胞的改進(jìn)工作流程，通過SCP檢測GFP信號，分離并分選轉(zhuǎn)染gRNAs的細(xì)胞。

用pmaxGFP質(zhì)粒和含有針對TNFSF11不同gRNAs的GFP標(biāo)記基因的pNV RANKL/KO質(zhì)粒CRISPR/Cas9敲除載體分別電轉(zhuǎn)染hTERT MSC。RANKL通過OPG/RANKL/RANK通路協(xié)調(diào)骨生成成骨細(xì)胞和骨降解破骨細(xì)胞之間的平衡，通過敲除TNFSF11基因，轉(zhuǎn)基因骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及其祖細(xì)胞不能再募集破骨細(xì)胞，以提高h(yuǎn)TERT MSC骨形成能力。pmaxGFP轉(zhuǎn)染的hTERT-MSCs作為對照來評估打印、分選和克隆效率，并優(yōu)化該過程。

電轉(zhuǎn)染細(xì)胞在37℃/5% CO2下培養(yǎng)24小時后，使用熒光分選的單細(xì)胞打印SCP技術(shù)（Cytena，f.sightTM）選擇并打印GFP表達(dá)的細(xì)胞，并根據(jù)大?。?5-30μm）和圓度（0.6-1）的形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)對其進(jìn)行分選。f.sightTM將細(xì)胞打印到96孔板（每孔200μl培養(yǎng)基），并在打印過程中對打印細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)拍攝記錄，證實克隆來自于單個細(xì)胞。（如下圖顯示）

只有符合要求的且含單個細(xì)胞的液滴被打印到孔板中

SCP記錄的五張圖像，轉(zhuǎn)染并表達(dá)GFP的hTERT-MSC的分離過程，噴射前01-03噴射時04和噴射后05

紅色標(biāo)記的點表示被分選事件，表明GFP表達(dá)的MSC具有潛在RANKL敲除

pmaxGFP轉(zhuǎn)染hTERT-MSCs單細(xì)胞打印參數(shù)：激光強(qiáng)度20-40%，曝光時間15-30ms，熒光閾值30-250RFU，pNV RANKL/KO轉(zhuǎn)染hTERT-MSCs的激光強(qiáng)度90-95%，曝光時間80-120ms，熒光閾值50-250RFU。

作者同時對打印細(xì)胞底板成像進(jìn)行手動評估，即熒光單細(xì)胞是否被成功分選并打印，或者是否將含多個、數(shù)量不確定、無細(xì)胞或非熒光細(xì)胞被送入孔中。共451個轉(zhuǎn)染的打印細(xì)胞，熒光單細(xì)胞打印效率為93.9±2.7%，只有6%的孔為無效打印，與f.sightTM所獲結(jié)果一致，提供>99.99%的保證。（如圖F顯示）

作者還注意到96孔板培養(yǎng)的已分選單細(xì)胞，轉(zhuǎn)染hTERT-MSCs（31.3±8.0%）和未轉(zhuǎn)染hTERT-MSCs（39.6±15.6%）的克隆效率差異很小，表明分選/打印過程是溫和的（對細(xì)胞剪切力可與手動移液相媲美），可以最小程度引入系統(tǒng)偏差。2周后對單個細(xì)胞獲得的克隆進(jìn)行計數(shù)，確定克隆效率（n=227個轉(zhuǎn)染的打印細(xì)胞，n=650個未轉(zhuǎn)染打印細(xì)胞）。（如圖G顯示）

這些結(jié)果證實，f.sightTM可以從形態(tài)學(xué)上區(qū)分細(xì)胞，并可對不同熒光強(qiáng)度的細(xì)胞進(jìn)行分選，GFP信號強(qiáng)的pmaxGFP轉(zhuǎn)染hTERT MSC和GFP信號弱的pNV RANKL/KO轉(zhuǎn)染hTERT MSC均成功分類。

在進(jìn)行轉(zhuǎn)染后，必須分離單個細(xì)胞，以產(chǎn)生可驗證為有效敲除的克隆。有限稀釋法和熒光激活細(xì)胞分選（FACS）很常見，但在效率、選擇控制和細(xì)胞活力等方面都不理想。有限稀釋法雖然經(jīng)濟(jì)，可能比FACS分選對細(xì)胞造成損傷小，但不能驗證其是由單個細(xì)胞長成的克隆，而且耗時耗資源，可能還會有些人為因素的影響；FACS雖然對單細(xì)胞有良好控制且通量高，但分選時產(chǎn)生的高剪切力和持續(xù)靜電，會對敏感或部分受損細(xì)胞（如電轉(zhuǎn)）的存活率/克隆效率有很大不良影響。

而正在興起的單細(xì)胞打印技術(shù)脫穎而出，它以一種非常溫和、低成本和高度可控技術(shù)，適合從0~40μm的各種特異性細(xì)胞克隆應(yīng)用。通過專利的噴墨式打印技術(shù)將單個細(xì)胞非接觸式的分離到標(biāo)準(zhǔn)的96/384/1536孔板中，實現(xiàn)高通量工作流程。特別適用于工程細(xì)胞的克隆，在維持細(xì)胞原有生命活力的同時，還為單細(xì)胞克隆性提供了直接的證據(jù)（提供每個打印細(xì)胞的可靠記錄），可根據(jù)細(xì)胞直徑、圓度和熒光強(qiáng)度進(jìn)行分選，并且可以整合到其它單細(xì)胞分析管路上，與各種下游流程的兼容性。不需要大規(guī)模克隆擴(kuò)增細(xì)胞，即可在細(xì)胞發(fā)育早期、高度并行階段得到包括DNA、RNA和蛋白質(zhì)水平等全面表征，降低了發(fā)育過程中后期失敗的機(jī)會。

通過自動化方式替代勞動密集和耗時的步驟來簡化細(xì)胞系開發(fā)等工作流程

德國cytena公司新開發(fā)的UP.SIGHT單細(xì)胞打印系統(tǒng)，在f.sight基礎(chǔ)上增加3D全孔成像，實現(xiàn)單細(xì)胞率>99.99 %。

除德國cytena單細(xì)胞打印系統(tǒng)外，公司還獨家代理轉(zhuǎn)染系統(tǒng)、生物反應(yīng)器、在線取樣系統(tǒng)、生化分析儀、在線分析系統(tǒng)等，為細(xì)胞培養(yǎng)工藝提供完全解決方案。特別推薦NEPA GENE高效基因轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，是被眾多文獻(xiàn)推薦的基因編輯首選電轉(zhuǎn)品牌！