凱氏定氮法與納什比色法測(cè)定植物組織中總氮含量的比較
氮是植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要營(yíng)養(yǎng)元素之一，植物葉片中氮素含量高低?？勺鳛槭┑?yīng)及氮素需要的診斷指標(biāo)。因此，氮素含量的測(cè)定在教學(xué)中是一個(gè)重要的教學(xué)內(nèi)容，在科研研究中是常測(cè)定的一個(gè)指標(biāo)。植物組織全氮測(cè)定常用方法是凱氏定氮法，即利用濃H2SO4-H2O2消煮，將樣品中有機(jī)物和有機(jī)含氮化合物轉(zhuǎn)化為無(wú)機(jī)銨鹽，再用蒸餾滴定的方法測(cè)定全氮含量。有文獻(xiàn)報(bào)道，植物樣品中氮的含量也可采用納什比色法測(cè)定，即獲得消化液后，采用納什比色方法測(cè)定消煮液中銨離子的濃度，然后通過(guò)計(jì)算獲得樣品中氮的含量。?
甘蔗是需氮量較大的作物，氮肥不足會(huì)影響甘蔗的生長(zhǎng)，氮營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩則會(huì)增加生產(chǎn)成本，造成肥料浪費(fèi)和環(huán)境污染。本試驗(yàn)利用H2SO4-H2O2法消化獲得消煮液，用蒸餾滴定法和納什比色法測(cè)定甘蔗葉片樣品中的全氮含量，分析比較2種方法的測(cè)定結(jié)果及其優(yōu)缺點(diǎn)，為植物樣品的快速測(cè)定提供一定的參考依據(jù)。?
1 材料與方法?
1.1材料來(lái)源?
取生長(zhǎng)盛期健康的甘蔗+3葉片，在105℃烘箱內(nèi)殺青30min，在60℃～70℃烘干至恒重，用粉碎機(jī)粉碎密封保存?zhèn)溆谩?
1.2待測(cè)液的獲得?
準(zhǔn)確稱取0.2g（精確至0.0001g）粉碎樣品置于消化管中，3次重復(fù)，加入5mL濃H2SO4，瓶口加一個(gè)小漏斗，搖勻，過(guò)夜，另取一個(gè)消化管，不加樣品，只加同樣的濃硫酸作為對(duì)照。將消化管置于控溫式遠(yuǎn)紅外消煮爐上消煮，中間視消化情況加1mLH2O21～2次加速氧化，直至消煮液呈無(wú)色或清亮色。待消化管冷卻，用少量水沖洗小漏斗，將消化液無(wú)損失轉(zhuǎn)入100mL容量瓶并定容，澄清上清液即為待測(cè)液。?
1.3滴定法測(cè)定全氮
對(duì)蒸餾裝置進(jìn)行洗滌，并確保干凈后，準(zhǔn)確吸取定容后的消煮液10.0mL于反應(yīng)器中開(kāi)始蒸餾，將餾出液出口的冷凝管下端管口插入盛有30ml的硼酸吸收液和5～6滴混合指示劑的三角瓶中，當(dāng)三角瓶中溶液開(kāi)始變綠時(shí)開(kāi)始記時(shí)，四分鐘后將三角瓶移離冷凝管口，繼續(xù)蒸餾1分鐘后將三角瓶移離蒸餾裝置，用水沖洗冷凝管及餾出液管，然后用0.01mol/LHCL標(biāo)準(zhǔn)酸滴定，溶液由綠色變?yōu)榈仙珵榈味ńK點(diǎn)并記錄所用酸體積，同時(shí)作一空白試驗(yàn)。依據(jù)公式計(jì)算全氮含量：?
N（%）=（V1-V0）×C×14×Ts×10-3×100/m?
其中：N：植株的全氮含量；V1：樣品測(cè)定值消耗標(biāo)準(zhǔn)酸的體積數(shù)（mL）；V0：空白試驗(yàn)所消耗標(biāo)準(zhǔn)酸的體積數(shù)（mL）；C：標(biāo)準(zhǔn)酸的濃度（mol/L）；14：氮原子的原子質(zhì)量（g/mol）；Ts：分取倍數(shù)；m：干樣品質(zhì)量（g）。?
1.4納什比色測(cè)定?
標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：分別吸取10μg/mLN（NH4-N）標(biāo)準(zhǔn)液0、2.50、5.00、7.50、10.00、12.50mL于6個(gè)50mL容量瓶中，每個(gè)加入100g/L酒石酸鈉溶液2mL，充分搖勻，加入納什試劑2.5mL，用水定容后充分搖勻。30min后用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)420nm測(cè)定。用所得數(shù)據(jù)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算NH4+濃度。?
吸取待測(cè)液2mL于50mL容量瓶中，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測(cè)定樣品中中的NH4+OD值，同時(shí)在樣品測(cè)定的同時(shí)做空白試驗(yàn)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算比色液中NH4+-N濃度，再根據(jù)下面公式計(jì)算含氮量。?
N（%）=p×V×Ts×10-4/m?
其中：p：從標(biāo)準(zhǔn)曲線查的顯色液N（NH4+-N）的質(zhì)量濃度（μg/mL）；V：顯色液體積（mL）；Ts-分取倍數(shù)：m：干樣品質(zhì)量（g）。?
2.結(jié)果與分析?
2.1比色方法的線性關(guān)系?
根據(jù)所測(cè)定的OD值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，標(biāo)準(zhǔn)曲線的函數(shù)關(guān)系式為Y=0.2228x-0.0297，相關(guān)系數(shù)R2=0.9995，線性關(guān)系較高，可以滿足試驗(yàn)的下一步計(jì)算。?
2.2兩種測(cè)定方法的結(jié)果比較?
試驗(yàn)中所采用的兩種測(cè)定方法結(jié)果的偏差除了第16號(hào)外，其他幾個(gè)樣品的結(jié)果偏差都小于2%，滴定法與納氏比色法比值大于1的樣品有1、8、10、13號(hào)（表1）。滴定法測(cè)定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)差和標(biāo)準(zhǔn)誤都小于納氏比色法測(cè)定結(jié)果，同時(shí)滴定法的變異系數(shù)也比納氏比色法的要小，但二者都小于2%（表2），兩種測(cè)定結(jié)果都是可靠的。對(duì)兩種測(cè)定方法的t檢驗(yàn)結(jié)果從表3可知，95%置信區(qū)間的上下限分別為0.017和0.174，t值為2.582大于0.021，說(shuō)明兩組測(cè)定結(jié)果之間差異不顯著，即用凱氏滴定法和納氏比色測(cè)定法兩種方法測(cè)定甘蔗樣品的全氮含量差異不顯著，表明用兩種方法的任何一種測(cè)定甘蔗葉片全氮，均不影響其試驗(yàn)結(jié)果。?
3 討論與結(jié)論?
凱氏定氮法是測(cè)定植物組織全氮的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法。該方法雖不需復(fù)雜的儀器設(shè)備，但滴定終點(diǎn)易受人為因素的影響，且蒸餾耗時(shí)太多，對(duì)快速批量測(cè)試來(lái)說(shuō)費(fèi)時(shí)費(fèi)力。納什比色法采用比色的方法，根據(jù)分光光度計(jì)比色槽的設(shè)定可同時(shí)測(cè)定5～7個(gè)樣品，避免人工蒸餾和滴定的繁瑣過(guò)程，大大提高了工作效率。?
本試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果表明，凱氏定氮法和納什比色法二者測(cè)定結(jié)果關(guān)系不顯著，其中凱氏滴定法變異系數(shù)小，蒸餾結(jié)果準(zhǔn)確可靠，優(yōu)于納什比色法，但納什比色法設(shè)備簡(jiǎn)單，效率較高，且與滴定法沒(méi)有達(dá)到顯著差異，如果樣品量較大，又僅僅是比較不同處理間的氮含量差異，納什比色法是一種快速效率較高的測(cè)定方法，減少了凱氏定氮法中的蒸餾與滴定操作，節(jié)省時(shí)間與資源，更為方便。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，可根據(jù)自己試驗(yàn)的目的要求，選擇合適的測(cè)定方法。?
值得注意的是要使測(cè)定結(jié)果有更好的準(zhǔn)確度，在測(cè)定過(guò)程中要認(rèn)真掌握各個(gè)細(xì)節(jié)及相應(yīng)的注意事項(xiàng)。如在滴定法測(cè)定時(shí)要注意加入NaOH量得控制，過(guò)多反應(yīng)劇烈，造成NH4+-N損失，過(guò)少蒸餾又不完全。[5，6]在應(yīng)用納什比色法測(cè)定時(shí)要注意顯色溶液的pH值應(yīng)≥11，NH4+-N的濃度控制在0.2～3.0mg/L；穩(wěn)定時(shí)間要有保證，當(dāng)溫度低時(shí)應(yīng)穩(wěn)定1h再進(jìn)行比色測(cè)定。[7]只有注意到這幾個(gè)測(cè)定細(xì)節(jié)，才能保證測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。?
因此，凱氏滴定法和納什比色法都可以用來(lái)測(cè)定甘蔗組織中的全氮含量，二者的測(cè)定結(jié)果差異不顯著。在方法選擇上，可根據(jù)自己的試驗(yàn)條件和試驗(yàn)?zāi)康囊?，選擇合適的測(cè)定方法，但在使用兩種方法的同時(shí)，應(yīng)該細(xì)致掌握各方法的注意事項(xiàng)。?
-
焦點(diǎn)事件
