光譜FCM---工作原理
一，全光譜流式細(xì)胞儀的技術(shù)特點(diǎn)（以SP6800為例）：
1， 用棱鏡分散發(fā)射光
2， 通過(guò)32個(gè)PMT從每個(gè)細(xì)胞獲得每個(gè)染料不同波段的發(fā)射光信號(hào)
3， 具有高速，高靈敏度，準(zhǔn)確，自動(dòng)和實(shí)時(shí)的算法。
4， 具有較寬的光譜檢測(cè)范圍和高光譜分辨率，并可區(qū)分光譜相近的FP和熒光素如FITC（Em 519 nm）和EGFP（Em 507nm）。
5， 可以測(cè)量和減去每個(gè)細(xì)胞的自發(fā)熒光，提高的信噪比和改善弱表達(dá)指標(biāo)的分辨率。
二，儀器的設(shè)計(jì)和關(guān)鍵部件
光譜FCM的光學(xué)示意圖如圖1a所示。SP6800配備488/638 nm激光器，流動(dòng)池芯片，光電二極管（PD），象限PD，10個(gè)連續(xù)棱鏡，微透鏡陣列和32通道線性陣列PMT（32ch PMT）。 此光譜FCM捕獲500 nm至800 nm多個(gè)波段熒光信號(hào)，連成光譜信息。
圖1.光譜FCM的設(shè)計(jì)
a）獨(dú)特光學(xué)設(shè)計(jì)：488/638 nm非共線，流動(dòng)池芯片，非晶硅PD，象限PD，棱鏡，微透鏡陣列和32ch PMT。
b）32ch PMT中每個(gè)通道對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)位置。獨(dú)特的棱鏡光學(xué)器件實(shí)現(xiàn)在藍(lán)綠色區(qū)域的通道比紅色區(qū)域更密，以增加該區(qū)域中的波長(zhǎng)分辨率。
c）流動(dòng)池芯片：藍(lán)色，綠色和粉色箭頭分別標(biāo)記鞘液，樣品和廢液流。紅色圓圈標(biāo)記由石英制成的檢測(cè)區(qū)域。
d）檢測(cè)Ultra Rainbow 8峰微球獲得的光譜圖。通過(guò)488nm激光激發(fā)（左）和638nm（右）分別顯示獲得的光譜。橫坐標(biāo)是500nm至800nm的波長(zhǎng)，縱坐標(biāo)是熒光強(qiáng)度。圖表中的顏色表示每個(gè)通道對(duì)應(yīng)強(qiáng)度的微球密度。紅色表示高密度，綠色表示中，藍(lán)色表示低。 左圖32ch PMT中的第20-23個(gè)通道被屏蔽，以防止638nm激光照射到PMT中。圖中的黃色箭頭表示當(dāng)光譜FCM以雙激光模式運(yùn)行時(shí)使用熒光數(shù)據(jù)的波長(zhǎng)區(qū)域。
e）截取PE信號(hào)波長(zhǎng)區(qū)域中的Ultra Rainbow 8峰微球獲得的數(shù)據(jù)的直方圖（圖1d；左，橙色虛線波長(zhǎng)范圍）。根據(jù)該數(shù)據(jù)可計(jì)算儀器的靈敏度MESF和線性。 54.0和527.8分別顯示來(lái)自最低強(qiáng)度微球（淺藍(lán)色）和第二低強(qiáng)度微球（紅色，緊鄰淺藍(lán)色）的平均熒光強(qiáng)度。
1，光學(xué)系統(tǒng)：
1.1， 光源
激發(fā)光光束功率分布通過(guò)聚焦透鏡形成垂直于流動(dòng)方向的平頂曲線，在峰值強(qiáng)度的80%處，寬度為40 um；沿流動(dòng)方向的光束分布為高斯，1/e2處為6 um。488/638nm激光點(diǎn)在空間上分離，流動(dòng)池芯片表面的激光功率分別為40mW和60mW，能夠分別自動(dòng)監(jiān)控。平頂光束確保細(xì)胞左右位置些微變化時(shí)，CV依然較好。
1.2，光收集系統(tǒng)
十個(gè)連續(xù)的棱鏡是高度透明的，涂有反射膜；之后是一個(gè)定制的微透鏡陣列組件將每個(gè)光帶聚焦到PMT陣列的特定通道上，從而避免熒光光子丟失到邊界遮罩上；32ch PMT檢測(cè)500-800nm的光。此光學(xué)系統(tǒng)的設(shè)計(jì)在大多數(shù)FPs和熒光染料集中的藍(lán)綠色區(qū)域分配更多的通道實(shí)現(xiàn)高分辨率（圖1b）。當(dāng)此光譜FCM以雙激光模式（488nm和638nm）運(yùn)行時(shí)，32ch PMT中的第20至23個(gè)通道（617-662nm）將自動(dòng)屏蔽，通過(guò)插入掩模防止638nm激光照射到PMT中。對(duì)于每個(gè)單細(xì)胞，488nm激發(fā)獲得28個(gè)通道（1–19和24–32）的熒光數(shù)據(jù)，638nm激發(fā)獲得9個(gè)通道（24–32），共獲得37個(gè)熒光通道數(shù)據(jù)（圖1d）。另一方面，在單激光模式（488nm激發(fā)）下運(yùn)行時(shí)，采集32個(gè)通道的熒光數(shù)據(jù)。這種光譜數(shù)據(jù)收集允許在傳統(tǒng)的FCM處理速率下輕松分離相近的熒光光譜而實(shí)現(xiàn)多色分析。32ch PMT的增益可以為每個(gè)通道單獨(dú)控制，也可以控制整個(gè)32ch陣列的總電壓。
通過(guò)原始物鏡收集的散射光被分束器分割，再被原始分帶鏡進(jìn)一步分割，這意味著低數(shù)值孔徑（NA）分量被反射為前向散射（FSC）信號(hào)，高數(shù)值孔徑（NA）分量被傳送為側(cè)向散射（SSC）信號(hào)。用非晶態(tài)硅PD檢測(cè)FSC和SSC，用FSC信號(hào)可檢測(cè)0.5 um到40 um的細(xì)胞尺寸。
第一反射散射信號(hào)用于使用散光聚焦算法控制Z焦點(diǎn)位置，以及使用象限PD跟蹤算法控制液流的中心位置（圖1a，橙色虛線），這種技術(shù)通常用于光盤(pán)伺服系統(tǒng)如CD和DVD。據(jù)此也可以確定細(xì)胞離開(kāi)中心樣本流的對(duì)應(yīng)X和Y的坐標(biāo)。因此可以自動(dòng)調(diào)整細(xì)胞和激光的正交。
2，液流系統(tǒng)
光譜FCM采用了可更換的流動(dòng)池芯片，而不是傳統(tǒng)的石英流動(dòng)室，它由塑料板和石英光學(xué)檢測(cè)組件組成，以減少更換流動(dòng)池芯片時(shí)的儀器停機(jī)時(shí)間（圖1c）。流動(dòng)池芯片的尺寸為75 mmX25 mmX2 mm，包含微流體通道，在基面上具有多個(gè)通道。有兩種類型的入口，一種用于測(cè)定的樣品，另一種用于鞘液，后者分為兩路，通過(guò)三維流體動(dòng)力聚焦用兩側(cè)鞘液流將樣本流束縛于液流的中心。典型的樣本流直徑約為10 um，可通過(guò)單獨(dú)改變樣品壓力和鞘液壓力來(lái)控制樣本流直徑。
光學(xué)探測(cè)區(qū)域由石英制成，以最大限度地減少自發(fā)熒光，并高效傳遞光源488nm和638nm能量到達(dá)細(xì)胞上。更換式流動(dòng)池芯片的優(yōu)點(diǎn)是避免細(xì)胞和蛋白吸附的影響，保持檢測(cè)區(qū)域表面的清潔。光譜FCM采用自動(dòng)芯片對(duì)準(zhǔn)機(jī)制，通過(guò)校準(zhǔn)微球SSC信號(hào)強(qiáng)度和變化來(lái)檢測(cè)和選擇每個(gè)芯片的最佳位置，并提示何時(shí)需要更換流動(dòng)池芯片，以防檢測(cè)區(qū)域表面上的殘留物造成不良堵塞或性能下降。
出廠時(shí)有三個(gè)鞘液流速低、中、高，分別約為3 m/s、5 m/s和10 m/s流速，樣品流速分別約為18 ul/min、30 ul/min和60 ul/min。本文的所有數(shù)據(jù)均以中速采集。樣本事件率約是每秒10000個(gè)（eps）。
3，電子系統(tǒng)
對(duì)于信號(hào)處理，在50MHz采樣頻率下，脈沖數(shù)據(jù)分辨率為信號(hào)高度20位和信號(hào)面積32位。通過(guò)額外的信號(hào)處理，光譜FCM不僅提供完整的光譜信息，還提供解析后的傳統(tǒng)流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)，展示成直方圖、雙參數(shù)散點(diǎn)圖，并可以實(shí)時(shí)顯示采樣信號(hào)變化情況。獲取的數(shù)據(jù)可以以FCS3.0和3.1的形式導(dǎo)出，進(jìn)行或不進(jìn)行光譜解混。
4，數(shù)據(jù)分析---光譜解混算法
光譜FCM根據(jù)最小二乘法（LSM），利用獨(dú)特的算法自動(dòng)分析獲得的全光譜數(shù)據(jù)，從而實(shí)現(xiàn)重疊熒光光譜的分離（圖2a）。我們的算法的基礎(chǔ)如下: 從單個(gè)染色樣品和未染色樣品中得到的每個(gè)光譜都被認(rèn)為是基本參考光譜。然后，利用每個(gè)染色和未染色參考光譜的分量，對(duì)多染色樣品進(jìn)行數(shù)學(xué)擬合和解混。數(shù)學(xué)上估計(jì)的系數(shù)值反映了多染色樣品組成中每個(gè)光譜的貢獻(xiàn)大小。然后，我們可以同時(shí)估計(jì)每個(gè)細(xì)胞中每種熒光素的熒光強(qiáng)度，而不需要任何復(fù)雜的常規(guī)補(bǔ)償。
mi表示K通道的基礎(chǔ)光譜值；y=（y1，…，yK）T表示K個(gè)通道的觀測(cè)譜，其中T表示轉(zhuǎn)換系數(shù)，ωi 倍增因子，e 噪聲，M 熒光染料的數(shù)目，然后事件數(shù)據(jù)被表示為方程。
當(dāng)只有一個(gè)熒光染料或熒光蛋白通過(guò)檢測(cè)時(shí)，基譜mi在某種程度上與標(biāo)準(zhǔn)化光譜的事件數(shù)據(jù)相同。實(shí)際上，熒光光譜通常是通過(guò)統(tǒng)計(jì)處理從單染樣品的多個(gè)事件數(shù)據(jù)的平均值計(jì)算出來(lái)的。另一方面，如果給出事件數(shù)據(jù)y和基譜mi，則ωi 倍增因子在數(shù)學(xué)上被估計(jì)。ωi 倍增因子被稱為熒光強(qiáng)度，是FCM中最重要的數(shù)字，因?yàn)橛脩艚?jīng)常通過(guò)觀察ωi的分布來(lái)判斷樣本信息。LSM是確定ωi的一種常用方法，它可以通過(guò)公式獲得(33)。公式表達(dá)為：
因此，LSM僅通過(guò)最小化殘余信號(hào)來(lái)估計(jì)所有熒光染料的貢獻(xiàn)，并且僅根據(jù)參考光譜對(duì)每個(gè)檢測(cè)通道施加相等系數(shù)的假設(shè)來(lái)計(jì)算熒光強(qiáng)度。
然而，眾所周知，F(xiàn)CM數(shù)據(jù)具有異方差性，這是基于強(qiáng)信號(hào)通道中的較大噪聲和弱信號(hào)通道中的較小噪聲。為了給每個(gè)檢測(cè)通道施加適當(dāng)?shù)臋?quán)重，我們開(kāi)發(fā)了加權(quán)最小平方法（WLSM），其中λk是在通道K的權(quán)重：
其中diag（k）是對(duì)角矩陣，在對(duì)角分量中具有λ=（λ1，…λk）T。我們還設(shè)置了一個(gè)偏移量，以避免在熒光信號(hào)變暗時(shí)使λk過(guò)大或?yàn)樨?fù)值。
圖2. 計(jì)算機(jī)模擬“光譜分離”和“熒光解離”的原理。
a） 光譜FCM解混算法利用所有標(biāo)記的熒光素的基譜來(lái)分離得到其不同的貢獻(xiàn)（上圖）。另一方面，傳統(tǒng)的補(bǔ)償只利用窄波段的光來(lái)扣除重疊的熒光發(fā)射（下圖）。
b） 488同時(shí)激發(fā)FITC和PE形成的光譜圖（上圖）。光譜解混前模擬數(shù)據(jù)熒光圖（下圖）。為了幫助識(shí)別每一個(gè)種群，有些群被標(biāo)識(shí)了不同的顏色。
c） FITC/PE, APC/APC-Cy7, PerCP/PerCP-Cy5.5, 和 AcGFP/FITC組合的光譜（上圖）。每個(gè)熒光的歸一化強(qiáng)度譜顯示為縱坐標(biāo)。由于這些模擬數(shù)據(jù)是在雙激光模式下產(chǎn)生的，因此將20到23之間的PMT通道的強(qiáng)度值指定為零。分別應(yīng)用LSM和WLSM算法后，F(xiàn)ITC/PE, APC/APCCy7, PerCP/PerCP-Cy5.5, 和 AcGFP/FITC組合的熒光圖（下圖）。為了幫助識(shí)別點(diǎn)圖中的每個(gè)群體，有些群體被標(biāo)識(shí)上不同的顏色。
d） 應(yīng)用LSM和WLSM后，兩種熒光染料的熒光強(qiáng)度比變化下的相對(duì)染色指數(shù)比較：FITC/PE, APC/APC-Cy7, PerCP/PerCP-Cy5.5, 和 AcGFP/FITC。熒光比是以第二熒光染料除以第一熒光染料作為橫坐標(biāo)，以相對(duì)染色指數(shù)作為縱坐標(biāo)。
5，計(jì)算機(jī)模擬
在計(jì)算機(jī)模擬中，基礎(chǔ)數(shù)據(jù)集是由未染色和單染樣本數(shù)據(jù)合成而成的。使用熒光微球(BD FACS 7-Color Setup Beads, BD Biosciences, CA)或綠色熒光蛋白(GFP)結(jié)合微球(AcGFP (34,35), Clontech Laboratories Inc.）,獲取未染和單染數(shù)據(jù)。綜合方程如下，我們定義s[k]為事件光譜，m和n為強(qiáng)度比。
需要注意的是，基礎(chǔ)數(shù)據(jù)集是基于實(shí)際采集的數(shù)據(jù)，包含了與儀器和樣品條件相關(guān)的各種因素影響如噪聲和偏差，如激光均方根、模擬/數(shù)字轉(zhuǎn)換噪聲、數(shù)字濾波器、PMT電壓、流速、細(xì)胞大小等。
我們模擬了四種不同的組合： FITC/PE、APC/APC-Cy7、PerCP/PerCP-Cy5.5和AcGFP/FITC。利用兩種不同的算法（LSM和WLSM）對(duì)這些數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并分析各細(xì)胞亞群的區(qū)分。相對(duì)染色指數(shù)是一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化的功能性指標(biāo)，用于量化群體分辨率，定義如下（36,37）。相對(duì)染色指數(shù)越高，分辨率越高。
D:陰陽(yáng)性群體之間的信號(hào)強(qiáng)度差
W:陰性峰MFI的2 SD值
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技術(shù)原理
