做代謝組學(xué)檢測(cè)的血液樣本怎么采集與前處理
采集:
由于生物樣本通常采用組內(nèi)平行樣本,不可避免的會(huì)由于時(shí)間、環(huán)境等因素產(chǎn)生“個(gè)體差異”,所以在采集動(dòng)物血液時(shí)需要使用麻醉劑以減少采血過程中動(dòng)物的疼痛感、不適感、創(chuàng)傷性,以減小應(yīng)激反應(yīng)造成的代謝物的變化、盡量縮短采集時(shí)間、保持一致的采集部位等細(xì)節(jié)問題;另外也考慮到樣本采集或制備的原則和易實(shí)現(xiàn)性,操作應(yīng)具有簡(jiǎn)便性和可重現(xiàn)性。
從生物體內(nèi)采集出的血液首先會(huì)收集到專用容器,如動(dòng)物實(shí)驗(yàn)使用注射器取血后可以直接存儲(chǔ)在EP管內(nèi)或采血管中,但若是從醫(yī)院檢驗(yàn)科采集的血液會(huì)首先存儲(chǔ)在專用的真空采血管內(nèi),管內(nèi)分別含有不同種類的抗凝劑、促凝劑等成分,適用于不同檢測(cè)項(xiàng)目,例如血清和血漿的生化試驗(yàn)、免疫試驗(yàn)、凝血試驗(yàn)、紅細(xì)胞沉降率試驗(yàn)、血常規(guī)檢測(cè)、血糖檢測(cè)等。常用的抗凝劑有EDTA、檸檬酸鈉、肝素鈉、肝素鋰,這些成分在與血液混合時(shí)不可避免地會(huì)產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng),如促進(jìn)或抑制血液中的細(xì)胞代謝、酶代謝,造成血液中小分子的種類和含量變化。有學(xué)者在血液與抗凝劑/促凝劑的相互作用方面進(jìn)行了研究,認(rèn)為肝素鈉相比于其他抗凝劑,與血液混合后引起的基質(zhì)效應(yīng)較弱,產(chǎn)生的雜質(zhì)較少,并且也滿足重現(xiàn)性要求,在代謝組學(xué)研究中若使用氣質(zhì)聯(lián)用或高分辨的液質(zhì)聯(lián)用作為主要分析技術(shù),建議選擇含有肝素鈉作為抗凝劑的采血管儲(chǔ)存離體血液。
前處理:
血液中含有血細(xì)胞,在采血后血細(xì)胞仍有短時(shí)間的存活,所以在采集血液樣本后需要盡快分離血細(xì)胞,例如高速離心可以將微小雜質(zhì)及血細(xì)胞沉淀,減少離體血細(xì)胞的代謝造成的影響。若不需要第一時(shí)間進(jìn)行分析,則應(yīng)該盡快分裝,并儲(chǔ)存在-80℃生物低溫冰箱中。從微觀角度來說,借鑒化學(xué)反應(yīng)速率常數(shù)隨溫度變化關(guān)系公式(阿倫尼烏斯公式),生物樣本的代謝活動(dòng)與樣本所處溫度成正相關(guān),在-80℃或液氮(-196℃)這種極低溫度下,血液中的酶或其他活性物質(zhì)的活動(dòng)才會(huì)減弱或停止,同時(shí)樣本中的水以晶體形式存在,減小了流動(dòng)性,分子的傳輸性極大減弱,避免樣本變質(zhì)或分解代謝,可保存數(shù)月數(shù)年。
血液樣本的前處理相比于尿液等其他類型的體液樣本,過程更多也更細(xì)致一些。原因是血液中含有的成分十分復(fù)雜,不同種類的化合物極性千差萬別,且存在種類較多、豐度較高的蛋白質(zhì)成分,通常采用一定比例的有機(jī)溶劑進(jìn)行渦旋震蕩萃取(有機(jī)溶劑沉淀法),使極性和非極性小分子物質(zhì)充分溶解在溶劑中,經(jīng)高速離心后得到的上清液和下相為小分子萃取液,沉淀物質(zhì)為蛋白及雜質(zhì)成分。廣泛使用的溶劑包括甲醇、水、乙腈,其他如丙酮、異丙醇等等低極性和高極性的溶劑需要根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)需求而單獨(dú)定制設(shè)計(jì)。
總體而言,血液樣本的采集與前處理看似簡(jiǎn)單,但過程中包含大量細(xì)節(jié)考慮與操作,應(yīng)盡可能標(biāo)準(zhǔn)化,但一種方法不可能適用于所有實(shí)驗(yàn),需要圍繞實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行充分的個(gè)性化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),樣本的采集和前處理遵循易實(shí)現(xiàn)性、易重現(xiàn)性、多組分保留等原則,在生物樣本的來源、采集、前處理等源頭把關(guān),保障實(shí)驗(yàn)最終數(shù)據(jù)與結(jié)果的可靠性,經(jīng)得起驗(yàn)證。