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Nucleofector核轉(zhuǎn)染系統(tǒng)助力CRISPR高效率基因編輯
在生命科學研究，臨床和生物技術(shù)的各種應(yīng)用中出現(xiàn)的多功能且易于使用的基因組編輯方法是CRISPR-Cas9。與其他基因組編輯技術(shù)（如鋅指核酸酶（ZFNs）和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)核酸酶（TALENs））相比，它具有許多優(yōu)勢，易于設(shè)計和使用，并具有靶向多個位點的能力。
CRISPR-Cas9系統(tǒng)基因編輯的特異性由指導(dǎo)RNA（gRNA）促進，gRNA與靶DNA的互補區(qū)段結(jié)合并在Cas9內(nèi)切核酸酶存在下直接進行DNA切割。決定基因編輯成功的一個重要因素是將CRISPR-Cas9組分有效轉(zhuǎn)入到被修飾的細胞中。一些研究已經(jīng)證明在永生化細胞系中成功地進行CRISPR-Cas9介導(dǎo)的遺傳修飾。然而，CRISPR-Cas9應(yīng)用可能因轉(zhuǎn)染“抵抗”而變得困難，特別是對于難以轉(zhuǎn)染的細胞，例如原代細胞或多能干細胞，即胚胎干細胞或誘導(dǎo)的多能干細胞。如何進一步提高轉(zhuǎn)染效率成為提高編輯效率的關(guān)鍵。
考慮使用RNPs
為了避免DNA毒性，克服mRNA不穩(wěn)定性，更好地控制編輯效果，可以嘗試使用RNP復(fù)合物作為轉(zhuǎn)染底物。RNP在體外由Cas9蛋白和gRNA構(gòu)建完成，轉(zhuǎn)染后立即開始基因組編輯過程，進一步減少編輯時間。此外，使用RNP，核酸酶不會長時間保留在細胞中，最小化脫靶效應(yīng)，并且劑量控制得到改善。基于RNP的轉(zhuǎn)染特別有利于原代細胞中的基因編輯或難以轉(zhuǎn)染的細胞，因為針對此類細胞使用DNA時會有高細胞毒性。否則使用基于DNA的方法顯示出高毒性。Seki和Rutz優(yōu)化了Cas9 RNP在原代小鼠和人T細胞中的轉(zhuǎn)染條件，將Cas9 RNP電轉(zhuǎn)到到活化的原代小鼠T細胞中實現(xiàn)的高敲除效率消除了進一步篩選的需要。
除了確定最佳轉(zhuǎn)染方法之外，鑒定最佳靶向的有效Cas9蛋白和gRNA也是重要的。另外，Cas9-gRNA比率和轉(zhuǎn)染的總量對于最終的結(jié)果也是至關(guān)重要的。
使用Nucleofector?
電轉(zhuǎn)技術(shù)提高轉(zhuǎn)染效率
有多種轉(zhuǎn)染方法可以將Cas9和gRNA（或單獨的crRNA和tracerRNA）轉(zhuǎn)染到細胞中。最常見的是lipofection，一種基于化學的轉(zhuǎn)染方法，使用脂質(zhì)體遞送CRISPR組分?？上У氖牵@種方法的轉(zhuǎn)染效率不高，尤其是對于原代細胞。也可以使用病毒載體將CRISPR底物遞送到細胞中。它的轉(zhuǎn)染效率比脂質(zhì)體高，但設(shè)計起來很費力，并且只能轉(zhuǎn)染DNA類型的底物，無法轉(zhuǎn)染mRNA底物或核糖核蛋白（RNP）。
一種有吸引力的替代方案是基于電穿孔的Nucleofector?技術(shù)。它已被證明是將CRISPR底物轉(zhuǎn)染到難以轉(zhuǎn)染的細胞中的有效非病毒方法。Nucleofector?技術(shù)通過提供獨特的電脈沖、細胞類型特異性解決方案和優(yōu)化的實驗方案來實現(xiàn)高轉(zhuǎn)染效率和高細胞活力，以實現(xiàn)直接靶向細胞核的先進電穿孔方法。與其他方法相比，這種強大的組合可帶來可重現(xiàn)、更快和更有效的結(jié)果，并可提供從研發(fā)到生產(chǎn)的多種應(yīng)用規(guī)格，在疾病研究和藥物發(fā)現(xiàn)以及基因進步方面具有廣泛的應(yīng)用，并推動著基因療法、免疫療法和干細胞生成的技術(shù)更新。
基于RNP與替代的轉(zhuǎn)染方式（如Nucleofector電轉(zhuǎn)技術(shù)）統(tǒng)連用的CRISPR-Cas9的基因組編輯方式，可以讓研究人員優(yōu)化實驗以獲得成功的CRISPR-Cas9基因組編輯，目前已有了顯著的進展。
2021年3月，美國斯坦福大學、貝勒醫(yī)學院等全球知名機構(gòu)的研究人員在國際頂級學術(shù)期刊Nature Medicine發(fā)表重磅研究論文，利用IDT的Alt-R? CRISPR/Cas9 基因編輯系統(tǒng)和Lonza的電轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，成功在小鼠模型中實現(xiàn)用β-珠蛋白替代α-珠蛋白來治療β-地中海貧血。
頂尖學術(shù)期刊《Nature》也在近期報道了一項癌癥治療領(lǐng)域的新突破：利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，將能夠精準識別癌細胞的TCR的基因序列通過CRISPR基因編輯，插入到了T細胞中。成功改造了免疫細胞，使其能特異性識別每名患者的癌細胞，并發(fā)動集中攻擊。該基因編輯過程采用了非病毒性載體進行遞送，能夠減少安全性的隱患。這是個體化基因編輯和抗癌細胞療法這兩大熱門領(lǐng)域的首次交匯，有望給癌癥治療帶來深遠的影響。
Nucleofector? 技術(shù)誕生已超過20年，這是一種被引用超過 10,000 次的非病毒細胞轉(zhuǎn)染方法。自開發(fā)以來的 20 年里，Nucleofector? 技術(shù)作為有效的非病毒細胞轉(zhuǎn)染方法引領(lǐng)市場，甚至可以用于難以轉(zhuǎn)染的細胞，例如原代細胞和多能干細胞。通過使用新一代 4D-Nucleofector?平臺，客戶現(xiàn)在可以受益于改進的用戶體驗和針對中等通量應(yīng)用的96 孔單元的完全集成。這個新版本帶有一個新的設(shè)計和用戶友好的實驗設(shè)置和數(shù)據(jù)管理軟件。4D-Nucleofector?平臺客戶可以期待持續(xù)的高標準性能以及更易于使用的技術(shù)支持?；?0年在外源基因轉(zhuǎn)導(dǎo)方法的開發(fā)經(jīng)驗，及大量的客戶反饋，Lonza開發(fā)出的4D-Nucleofector? 以最大化的靈活性和可靠性滿足客戶的需求。除384-well Nucleofector外，Lonza還可以提供不同維度的轉(zhuǎn)染模塊來應(yīng)對不同的場景需求。
