蛋白質(zhì)分離純化一條街：凝膠過(guò)濾層析

凝膠過(guò)濾層析（Gel Filtration Chromatography，GFC）又稱

尺寸排阻層析（Size Exclusion Chromatography，SEC）

凝膠滲透層析（Gel Permeation Chromatography，GPC）

分子篩層析（Molecular Sieve Chromatography，MSC）

注：在高效液相色譜分析中，用GFC或SEC表示凝膠過(guò)濾色譜或尺寸排阻色譜，流動(dòng)相通常是水溶液；在有機(jī)高分子分析中，常用GPC表示凝膠滲透色譜，流動(dòng)相通常是有機(jī)溶劑；在蛋白質(zhì)分離純化中用GFC或SEC表示凝膠過(guò)濾層析或尺寸排阻層析；本文以下內(nèi)容均針對(duì)蛋白質(zhì)分離，因此均以凝膠過(guò)濾層析（GFC）表示。

（1）分離機(jī)理

GFC填料是由高分子交聯(lián)而成、內(nèi)部具有網(wǎng)狀篩孔的固體顆粒，利用球狀凝膠內(nèi)的篩孔的大小，不同水力學(xué)半徑的分子在通過(guò)填料時(shí)運(yùn)行路徑存在差異，利用該差異將不同大小的蛋白質(zhì)進(jìn)行分離。

蛋白質(zhì)分子流過(guò)填充凝膠的管柱時(shí)，大分子無(wú)法進(jìn)入凝膠篩孔，而只流經(jīng)凝膠及管柱間的孔隙，因此總體運(yùn)行路徑較短，從層析柱入口到出口所需時(shí)間較短；較小的分子因?yàn)檫M(jìn)入凝膠內(nèi)的篩孔，總體運(yùn)行路徑較長(zhǎng)，故在管柱內(nèi)的停留時(shí)間較長(zhǎng)；基于此原理可以區(qū)分大小不同的分子，亦可與已知大小的分子作比較而確定未知樣品的分子量。

注1：球形蛋白與線性分子在凝膠過(guò)濾層析中的保留行為存在差異，因此使用球形蛋白制作的分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線不能用于明膠多肽、淀粉或其它聚合物。

（2）應(yīng)用范圍

A 蛋白質(zhì)分離，基于混合中不同蛋白質(zhì)分子尺寸大小進(jìn)行分離；

B 分子量測(cè)定，蛋白質(zhì)分子量（球形）的對(duì)數(shù)與其在凝膠過(guò)濾層析時(shí)的保留時(shí)間呈線性關(guān)系；

C 樣品脫鹽或溶劑置換。

（3）填料要求

一般狀況下，用于制備凝膠過(guò)濾層析的填料應(yīng)不吸附目標(biāo)成份，所有欲分離物質(zhì)均被洗脫出，這是凝膠層析法與其它層析法不同的地方。凝膠的材質(zhì)需為化學(xué)惰性，與分離物不能產(chǎn)生變性（denature）或是其它化學(xué)反應(yīng)，最好具有能長(zhǎng)期反復(fù)使用的穩(wěn)定性，并可以在較大的pH和溫度范圍內(nèi)使用。凝膠要有一定的機(jī)械強(qiáng)度，在層析過(guò)程中才不會(huì)變形，增加機(jī)械強(qiáng)度也可使層析在較高壓力的環(huán)境進(jìn)行，縮短分離時(shí)間。

（4）凝膠過(guò)濾常用填料種類

目前常用的凝膠包括3個(gè)主要類型：

A：葡聚糖凝膠（Polydextran），商品名稱是Sephadex

Polydextran幾乎不溶于溶劑中，親水性強(qiáng)，能迅速在水和電解質(zhì)溶液中膨脹，在堿性的環(huán)境中十分穩(wěn)定，所以可以用堿去除凝膠上的污染物。

Sephadex G-X，X表示葡聚糖的交聯(lián)程度，數(shù)值越大則交聯(lián)度越小，但吸水量越高，X值大致是吸水量的10倍。以Sephadex G-25為例，表示1克干燥的G-25凝膠可以吸水2.5 ml。

Sephadex的分離范圍與填料粒經(jīng)和交聯(lián)度密切相關(guān)，大概范圍如下：

型號(hào)   粒度（微米） 有效分離范圍（球形蛋白質(zhì)）

G 10   55－166      <700

G 15   60-180       <1500

G 25   -            1000-5000

G 50   -            1500-30000

G 75   -            3000-80000

G 100  -            4000-150000

G 150  -            5000-300000

G 200  -            5000-600000

Superdex屬于葡聚糖以共價(jià)結(jié)合到交聯(lián)多孔瓊脂糖珠體上的球形凝膠，流速快、反壓低。

型號(hào)      粒度（微米） 有效分離范圍（球形蛋白質(zhì)）

Superdex 30  24-44        <10000

Superdex 75  24-44        3000-70000

Superdex 200              10000-600000

B  聚丙稀酰胺凝膠（Polyacrylamide）

Polyacrylamide是一種合成凝膠，商品名Bio-Gel P，干粉顆粒狀。依膠的分離范圍不同，分成Bio-Gel P-2至Bio-Gel P-300，P后面的數(shù)字乘以1000為最大過(guò)濾限度。Polyacrylamide的化學(xué)性質(zhì)不活潑，但它在極端的pH下會(huì)被水解，水解后產(chǎn)生的COOH-具有離子交換的性質(zhì)，因此pH 值應(yīng)盡量控制在2-10之間。

型號(hào)            粒度（微米） 有效分離范圍（球形蛋白質(zhì)）

Bio-Gel P-2        -      <1800

Bio-Gel P-4        -      800-4000

Bio-Gel P-6        -      1000-6000

Bio-Gel P-10       -      1500-20000

Bio-Gel P-30       -      2500-40000

Bio-Gel P-60       -      3000-60000

C  瓊脂糖凝膠

商品名稱Sepharose，由屬于天然凝膠，依凝膠中干膠的百分含量，分為Sepharose 2B，4B和6B。Agarose gel 是一種大孔凝膠，主要用于像核酸或病毒這些分子量400,000以上的物質(zhì)，因其顆粒軟，在分離過(guò)程有時(shí)會(huì)阻塞管柱，造成流速減慢，又因其在攝氏50度以上會(huì)融化，故需于較低溫的環(huán)境中進(jìn)行層析。Agarose 做成beads后不能再脫水干燥，所以要在濕態(tài)中保存。

經(jīng)2，3－二溴丙醇反應(yīng)交聯(lián)而成的凝膠為Sepharose CL型凝膠

型號(hào)                     粒度（微米） 有效分離范圍（球形蛋白質(zhì)）

Sepharose 2B                70000－40000000

Sepharose 4B                60000－20000000

Sepharose 6B                10000－4000000

Sepharose CL-2B             70000－40000000

Sepharose CL-4B             60000－20000000

Sepharose CL-6B             10000－4000000

Superpose 瓊脂糖經(jīng)多次交聯(lián)形成的凝膠。

型號(hào)            粒度（微米） 有效分離范圍（球形蛋白質(zhì)）

Superose 6          5000－5000000

Superose 12          1000－300000

其它凝膠：聚丙稀酰胺葡聚糖凝膠，交聯(lián)聚苯乙烯凝膠，聚乙烯醇凝膠等，還有更多新型號(hào)的凝膠。

4  操作實(shí)例（轉(zhuǎn)載）

1） 凝膠溶脹

凝膠顆粒要求大小比較均勻 ，可流速穩(wěn)定，結(jié)果較好。取葡聚糖Sephardex G-75干粉，加過(guò)量的蒸餾水室溫充分溶脹一天（溶脹時(shí)間因凝膠交聯(lián)度不同而不同），或沸水浴中溶脹3小時(shí)，這樣可大大縮短溶脹時(shí)間，而且可以殺死細(xì)菌和霉菌，并可排出凝膠內(nèi)氣泡。溶脹過(guò)程中注意不要過(guò)分?jǐn)嚢?，以防顆粒破碎。待溶脹平衡后用傾瀉法除去不易沉下的細(xì)小顆粒，最后凝膠經(jīng)減壓抽氣除去氣泡，即可準(zhǔn)備裝柱。