本應(yīng)用簡報介紹了使用ACQUITY Premier UPLC與Xevo G3 QTof質(zhì)譜儀的聯(lián)用系統(tǒng)分析完整賴氨酸偶聯(lián)的抗體偶聯(lián)藥物(ADC)的情況。使用MaxEnt1去卷積數(shù)據(jù)計算藥物抗體比(DAR)，這是一項衡量ADC治療藥物安全性和有效性的關(guān)鍵指標(biāo)。在合規(guī)的waters_connect信息學(xué)平臺上運行waters_connect? UNIFI?應(yīng)用程序的完整質(zhì)量數(shù)工作流程，進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和處理。

優(yōu)勢

• ADC工作流程采用UNIFI應(yīng)用程序中的自定義計算功能自動計算DAR，工作流程化繁為簡，并降低了手動處理或報告錯誤的風(fēng)險

• ACQUITY Premier UPLC系統(tǒng)采用高性能表面(HPS)，可延長系統(tǒng)正常運行時間，并提供一致的分析物回收率

• 高分辨率臺式Xevo G3 QTof質(zhì)譜儀，靈敏度高、穩(wěn)定性好，能夠檢測生物分子

簡介

近年來，抗體偶聯(lián)藥物(ADC)在改善癌癥治療方面的發(fā)展勢頭十分強勁。截至2023年，F(xiàn)DA已經(jīng)批準(zhǔn)了11種ADC治療藥物，可用于多種癌癥類型1-2。 ADC是一種單克隆抗體(mAb)，通過連接子與藥物毒素偶聯(lián)，從而靶向遞送至癌細(xì)胞。連接子-藥物通常通過化學(xué)反應(yīng)與mAb蛋白質(zhì)序列中的賴氨酸或半胱氨酸偶聯(lián)，或通過靶向位點蛋白質(zhì)工程偶聯(lián)。本應(yīng)用簡報的案例研究使用Kadcyla?（曲妥珠單抗-美坦新偶聯(lián)物）作為模型分子，重點關(guān)注賴氨酸偶聯(lián)類別的ADC。賴氨酸偶聯(lián)的ADC往往表現(xiàn)出明顯的異質(zhì)性，這是因為序列中存在大量表面可及的賴氨酸殘基，且該反應(yīng)對任何給定位點均無特異性。這種偶聯(lián)方式會得到一種連接子-藥物基團(tuán)以不同偶聯(lián)水平連接到mAb的分布情況。

為評估整體藥物分布和DAR，研究人員通常會對這些異質(zhì)性ADC進(jìn)行完整mAb LCMS分析。本應(yīng)用簡報展示了使用ACQUITY Premier UPLC與Xevo G3 QTof質(zhì)譜儀的聯(lián)用系統(tǒng)進(jìn)行高質(zhì)量、高靈敏度ADC分析的能力。使用合規(guī)的waters_connect信息學(xué)平臺內(nèi)的UNIFI應(yīng)用程序自動采集和分析數(shù)據(jù)（圖1）。

圖1.使用ACQUITY Premier UPLC（BSM、FTN、TUV）與Xevo G3 QTof質(zhì)譜儀的聯(lián)用系統(tǒng)進(jìn)行采集。使用waters_connect信息學(xué)平臺內(nèi)的UNIFI應(yīng)用程序采集、處理和報告數(shù)據(jù)。

結(jié)果與討論

在本應(yīng)用簡報中，我們使用PNGaseF酶處理曲妥珠單抗和Kadcyla（曲妥珠單抗-美坦新偶聯(lián)物）ADC樣品（去除N-糖基化修飾），以簡化完整mAb和偶聯(lián)mAb結(jié)構(gòu)的反相LCMS分析。有關(guān)完整mAb RP-LCMS的方法詳細(xì)信息，請參閱應(yīng)用紀(jì)要720007635ZH3。 本分析啟用了智能數(shù)據(jù)捕獲(IDC)功能，以實時降低背景噪音。

得到的合并原始譜圖鏡像圖（圖2）表明，糖基釋放后的ADC（紅色）與糖基釋放后的未偶聯(lián)曲妥珠單抗（藍(lán)色）相比，復(fù)雜性明顯更高。Xevo G3 QTof質(zhì)譜儀只需500 ng柱上進(jìn)樣量即可檢出這些復(fù)雜物質(zhì)。利用UNIFI應(yīng)用程序的完整蛋白質(zhì)工作流程采集并分析數(shù)據(jù)。使用MaxEnt1去卷積和手動峰寬模型執(zhí)行自動化數(shù)據(jù)處理，該模型使用手動測量的電荷態(tài)包絡(luò)高端和低端峰的半峰全寬(FWHM)值。本例中測得的值均為0.8 m/z。輸入m/z范圍為2200–3400，輸出質(zhì)量范圍為140–155 kDa，輸出分辨率為1.0 Da。最多執(zhí)行25次MaxEnt1處理循環(huán)迭代以進(jìn)行譜圖去卷積。將得到的去卷積質(zhì)量數(shù)（圖3）與偶聯(lián)0-10個連接子-藥物的可變修飾進(jìn)行質(zhì)量比對，由于輸出質(zhì)譜的復(fù)雜性，50 ppm質(zhì)量誤差容差設(shè)置為平均預(yù)期質(zhì)量精度的3倍。在去卷積譜圖中檢出了預(yù)期的DAR物質(zhì)，以及額外的僅含連接子的系列。這些僅含連接子的物質(zhì)為雜質(zhì)，可通過本方法監(jiān)測，但不計入DAR計算。如圖4所示，觀察到藥物分布范圍為0–9個偶聯(lián)物質(zhì)。

圖2.糖基釋放后的Kadcyla ADC（紅色）和未偶聯(lián)曲妥珠單抗（藍(lán)色）的組合原始m/z譜圖鏡像圖，各自的右側(cè)插圖為部分放大圖，以突出顯示偶聯(lián)樣品的復(fù)雜性。

圖3.糖基釋放后的Kadcyla ADC的MaxEnt1去卷積譜圖，插圖為部分放大圖，以突出顯示微量物質(zhì)的分辨率。

圖4.Kadcyla ADC樣品的去卷積質(zhì)譜圖（按峰面積確定質(zhì)心），顯示藥物分布范圍為0-9個藥物，可用于DAR（藥物抗體比）計算。圖中顯示了每種物質(zhì)的質(zhì)量精度值，該值遠(yuǎn)低于50 ppm的質(zhì)量比對容差閾值。

DAR值是樣品中未偶聯(lián)和偶聯(lián)物質(zhì)響應(yīng)的加權(quán)平均值，通常用作判斷偶聯(lián)過程一致性和ADC潛在效力的指標(biāo)。通過使用自定義計算，可以在工作流程中實現(xiàn)DAR值的自動計算。UNIFI使用載藥量和MS響應(yīng)自動計算每種物質(zhì)的加權(quán)平均值。該Kadcyla（曲妥珠單抗-美坦新偶聯(lián)物）樣品的DAR計算值為3.53，與之前發(fā)表的表征研究結(jié)果相當(dāng)2。 waters_connect部署的默認(rèn)方法中包含一個自動執(zhí)行DAR計算的模板，研究人員可利用該模板快速優(yōu)化ADC DAR計算方法。 

結(jié)論

ACQUITY Premier UPLC與Xevo G3 QTof質(zhì)譜儀的聯(lián)用系統(tǒng)為糖基釋放后的Kadcyla（曲妥珠單抗-美坦新偶聯(lián)物）ADC提供了高質(zhì)量的完整mAb數(shù)據(jù)。UNIFI完整蛋白分析工作流程支持?jǐn)?shù)據(jù)采集、自動化MaxEnt1去卷積、質(zhì)量比對、DAR計算和報告，所有功能都在waters_connect信息學(xué)平臺的合規(guī)架構(gòu)內(nèi)。Kadcyla是Genentech的商標(biāo)。Xevo、waters_connect、UNIFI和ACQUITY是沃特世科技公司的商標(biāo)。

參考資料

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2. Chen L, Wang L, Shion H, Yu C, Yu YQ, Zhu L, Li M, Chen W, Gao K. In-Depth Structural Characterization of Kadcyla? (ado-trastuzumab emtansine) and its Biosimilar Candidate.mAbs.2016.8:7, 1210–1223.

3. Ippoliti S, Cornwell O, Reid L, Yu YQ, Harry E, Towers M. 使用Xevo G3 QTof系統(tǒng)通過完整和亞基RP-MS和IEX-UV-MS進(jìn)行全面的生物類似藥可比性評估.沃特世應(yīng)用紀(jì)要 720007635ZH.2022.

Samantha Ippoliti Ying Qing Yu, Waters Corporation