本應(yīng)用簡(jiǎn)報(bào)將展示BioAccord系統(tǒng)在非變性條件下分析抗體偶聯(lián)藥物(ADC)的性能。

優(yōu)勢(shì)

利用分析型體積排阻色譜(SEC)和基于非變性LC-MS分析的BioAccord系統(tǒng)測(cè)定Lys和Cys偶聯(lián)ADC的藥物偶聯(lián)比(DAR)。

簡(jiǎn)介

藥物偶聯(lián)比(DAR)是ADC的一種關(guān)鍵質(zhì)量屬性(CQA)，因?yàn)樗苯佑绊慉DC的治療效果和藥代動(dòng)力學(xué)。在ADC開發(fā)過程和商業(yè)化生產(chǎn)運(yùn)營(yíng)中，DAR的測(cè)定（和監(jiān)測(cè)）至關(guān)重要。非變性電噴霧質(zhì)譜（非變性質(zhì)譜）已成為分析共價(jià)復(fù)合蛋白質(zhì)治療藥物和非共價(jià)蛋白質(zhì)復(fù)合體的有力工具。在非變性質(zhì)譜條件下，使用兼容MS的非變性緩沖液體系對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行電噴霧電離。

這些LC-MS分析條件使許多蛋白質(zhì)能夠保持折疊狀態(tài)，這些狀態(tài)表現(xiàn)出特征性低電荷態(tài)，與分析變性蛋白相比，需要在更寬和更高的質(zhì)荷比(m/z)范圍內(nèi)具有出色的靈敏度。非變性質(zhì)譜面臨多種獨(dú)有的難題，包括在嘗試使用注入式MS時(shí)，需要在分析前進(jìn)行大量樣品凈化，并要求操作人員擁有更高的技術(shù)水平以獲得并解析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。之前，我們致力于通過將在線SEC與現(xiàn)有MS技術(shù)聯(lián)用來簡(jiǎn)化非變性質(zhì)譜數(shù)據(jù)的采集1,2，促進(jìn)樣品脫鹽和緩沖液交換，以研究半胱氨酸偶聯(lián)ADC藥物。本研究采用BioAccord系統(tǒng)來改善非變性質(zhì)譜法分析半胱氨酸偶聯(lián)ADC和賴氨酸偶聯(lián)ADC的易用性。

BioAccord系統(tǒng)是一種小體積、高性能的臺(tái)式系統(tǒng)，其經(jīng)過精心地開發(fā)和設(shè)計(jì)，具有簡(jiǎn)單的用戶界面，還配備自動(dòng)系統(tǒng)設(shè)置和自檢功能。

結(jié)果與討論

BioAccord系統(tǒng)由ACQUITY UPLC I-Class PLUS系統(tǒng)組成，該系統(tǒng)配備與ACQUITY RDa檢測(cè)器（緊湊型oa-TOF MS）串聯(lián)的光學(xué)檢測(cè)器（TUV或FLR）。該系統(tǒng)在UNIFI科學(xué)信息系統(tǒng)下運(yùn)行，通過組合自動(dòng)化數(shù)據(jù)采集、處理和報(bào)告功能，為法規(guī)依從性和非法規(guī)依從性實(shí)驗(yàn)室提供精簡(jiǎn)的流程式解決方案，包括自動(dòng)化實(shí)現(xiàn)對(duì)ADC表征進(jìn)行DAR計(jì)算。 

半胱氨酸偶聯(lián)ADC分析

半胱氨酸偶聯(lián)ADC分析采用非變性質(zhì)譜分析法，需要在非變性條件下保持非共價(jià)連接的ADC分子完整，從而確定ADC樣品的DAR值和載藥量分布。本研究將BioAccord系統(tǒng)直接與分析型SEC色譜柱（ACQUITY UPLC BEH SEC蛋白分析專用柱, 200?, 1.7 μm, 2.1 mm × 150 mm，部件號(hào)186008471）聯(lián)用進(jìn)行等度洗脫（50 mM醋酸銨(NH4OAc)，運(yùn)行時(shí)間10分鐘）。

在這些SEC條件下，ADC亞基保持在近天然狀態(tài)，保持四級(jí)結(jié)構(gòu)相互作用，產(chǎn)生的表面積遠(yuǎn)小于利用酸性-有機(jī)流動(dòng)相進(jìn)行典型的反相分離時(shí)所發(fā)現(xiàn)的變性、未折疊形式。在非變性電噴霧質(zhì)譜條件下，蛋白質(zhì)帶電量比反相條件下少，并且在所得質(zhì)譜圖中，較小的電荷峰簇出現(xiàn)在較高的m/z范圍內(nèi)。如圖1所示，BioAccord系統(tǒng)的擴(kuò)展質(zhì)量范圍（高達(dá)m/z 7000）滿足高m/z測(cè)量的需要，并展示了復(fù)雜的非糖基釋放半胱氨酸偶聯(lián)ADC的檢測(cè)結(jié)果。這些結(jié)果與之前在其他高分辨率質(zhì)譜系統(tǒng)上分析得到的ADC樣品譜圖一致1,2，在BioAccord和之前的QTof MS系統(tǒng)之間獲得了相當(dāng)?shù)腄AR值（圖1和表1）。

組合原始譜圖電荷峰簇（圖1，左圖）、放大單電荷態(tài)（中圖）和去卷積譜圖（右圖）顯示了在BioAccord系統(tǒng)上獲得的裸抗體mAb和三個(gè)水平（低、中、高）偶聯(lián)ADC的結(jié)果。裸mAb譜圖中顯示了所有三個(gè)濃度水平的偶聯(lián)樣品中針對(duì)各種偶聯(lián)形式（0、2、4、6和8）重復(fù)的糖基化模式。在UNIFI數(shù)據(jù)處理工作流程內(nèi)，利用去卷積譜圖中各糖型的加合積分峰面積自動(dòng)計(jì)算總平均DAR和載藥量分布，如之前的文獻(xiàn)所詳述1。

圖1.利用BioAccord系統(tǒng)進(jìn)行非變性LC(SEC)-MS分析，在不經(jīng)糖基釋放處理的情況下得到標(biāo)準(zhǔn)品(mAb)以及低、中和高偶聯(lián)水平半胱氨酸偶聯(lián)ADC樣品的多電荷峰簇的組合原始譜圖（左圖）、組合原始譜圖的放大區(qū)域（單電荷態(tài)）（中圖）和去卷積譜圖（右圖）。比較三種不同半胱氨酸偶聯(lián)ADC樣品隨載藥量增加的藥物分布。

表1.HIC (UV)和三個(gè)非變性SEC-MS實(shí)驗(yàn)中的總平均DAR和藥物分布比較，所有三種載藥量下的結(jié)果一致。結(jié)果表明，使用正交方法（HIC與MS）或者不同QTof或Tof MS系統(tǒng)（Xevo G2-S、Vion IMS QTof MS和BioAccord系統(tǒng)）能夠?qū)崿F(xiàn)一致的DAR測(cè)量。BioAccord系統(tǒng)具備自動(dòng)化數(shù)據(jù)采集、處理和報(bào)告DAR計(jì)算結(jié)果的精簡(jiǎn)工作流程，能夠有效進(jìn)行ADC的非變性LC(SEC)-MS分析，以確定批號(hào)間、批次間可比性。

賴氨酸偶聯(lián)ADC數(shù)據(jù)

在無需進(jìn)行樣品糖基釋放的情況下，對(duì)賴氨酸偶聯(lián)ADC Kadcyla（曲妥珠單抗-美坦新偶聯(lián)物(T-DM1)）進(jìn)行LC(SEC)-MS分析獲得原始譜圖和去卷積譜圖（圖2）。已有文獻(xiàn)詳細(xì)介紹過使用非變性質(zhì)譜方法分析共價(jià)賴氨酸偶聯(lián)ADC的優(yōu)勢(shì)2。在去卷積譜圖的峰上標(biāo)記出檢測(cè)到的偶聯(lián)藥物數(shù)量。利用UNIFI計(jì)算得出的DAR值為3.46，與藥品生產(chǎn)商報(bào)告的DAR (3.50)較為一致3。同樣，結(jié)果與之前使用Vion IMS QTof系統(tǒng)得到的研究結(jié)果相當(dāng)2。

圖2.利用BioAccord系統(tǒng)對(duì)賴氨酸偶聯(lián)ADC Kadcyla（曲妥珠單抗-美坦新偶聯(lián)物(T-DM1)）進(jìn)行LC(SEC)-MS分析得到的原始譜圖和去卷積譜圖。去卷積譜圖上標(biāo)記的數(shù)字代表檢測(cè)到的藥物數(shù)量（偶聯(lián)至完整蛋白水平的曲妥珠單抗上）。計(jì)算出的平均DAR為3.46，公布的DAR為3.503。實(shí)驗(yàn)在ADC藥物不經(jīng)糖基釋放處理的情況下進(jìn)行。

結(jié)論

在本應(yīng)用簡(jiǎn)報(bào)中，我們證明BioAccord系統(tǒng)非常適用于對(duì)半胱氨酸偶聯(lián)ADC和賴氨酸偶聯(lián)ADC進(jìn)行LC(SEC)-非變性質(zhì)譜分析。平均DAR和載藥量分布結(jié)果與疏水作用色譜(HIC)分離（配備TUV檢測(cè)）產(chǎn)生的結(jié)果以及利用前幾代QTof MS系統(tǒng)所得到的結(jié)果相當(dāng)。BioAccord系統(tǒng)簡(jiǎn)化了操作并具備可配置的合規(guī)功能，即使是MS經(jīng)驗(yàn)不足的科學(xué)家也能輕松應(yīng)用，有助于組織更容易地部署質(zhì)譜儀，以支持ADC的開發(fā)和生產(chǎn)過程。本技術(shù)簡(jiǎn)報(bào)及其他介紹BioAccord系統(tǒng)的已出版應(yīng)用文獻(xiàn)4-8表明，BioAccord系統(tǒng)功能廣泛，適用于支持生物治療藥產(chǎn)品質(zhì)量屬性的常規(guī)分析。

參考資料

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