細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)（二）
4.3.3.2漩渦混合器
作用：混旋細(xì)菌內(nèi)毒素
標(biāo)準(zhǔn)品，保證標(biāo)準(zhǔn)品溶液
的濃度一致。
方式：
對凍干粉的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)溶后，應(yīng)混旋15min。
標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋過程中，每步稀釋應(yīng)混旋30s.
4.3.3.3試管恒溫儀：
作用：提供37℃恒溫的環(huán)境。
方式：
對加入了內(nèi)容物的鱟試劑分別放置于試管恒溫儀中，37℃恒溫60min±2min溫育培養(yǎng)后，觀察結(jié)果。
4.3.4試劑：
細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品：工作標(biāo)準(zhǔn)品、國家標(biāo)準(zhǔn)品
鱟試劑：利用鱟血液中的變性細(xì)胞，經(jīng)裂解液和機(jī)械方式促使細(xì)胞破裂而提取到的一種細(xì)胞溶解物，能與極微量的細(xì)菌內(nèi)毒素形成特異凝膠反應(yīng)，反應(yīng)的速度和凝膠的堅(jiān)固程度與內(nèi)毒素濃度有關(guān)，是體外檢測內(nèi)毒素的敏感試劑。
細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水：含細(xì)菌內(nèi)毒素的量極低：<0.015EU/ml ，不引入細(xì)菌內(nèi)毒素，對內(nèi)毒素試驗(yàn)無干擾作用。
4.3.5試驗(yàn)過程：
在進(jìn)行日常檢驗(yàn)前，需要進(jìn)行鱟試劑靈敏度復(fù)核和供試品干擾試驗(yàn)，確定鱟試劑的標(biāo)示靈敏度的準(zhǔn)確性和供試品的最大有效稀釋倍數(shù)、最小稀釋倍數(shù)。
靈敏度復(fù)核試驗(yàn)：
每批鱟試劑用于檢測前都必須進(jìn)行靈敏度復(fù)核。
試驗(yàn)舉例： 內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品為100EU/支；
待測鱟試劑靈敏度λ＝0.25EU/ml。
1）制備內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液：取工作標(biāo)準(zhǔn)品一支，輕彈瓶壁使粉末落入瓶底，用砂輪在瓶頸出劃痕，用75％酒精擦拭后啟開，加1mlBET水溶解，封口膜封住，置漩渦振蕩器上混勻15min后進(jìn)行稀釋，步驟如下：
2）溶解鱟試劑：若鱟試劑為0.1ml裝量，則取18支，每支加入0.1mlBET水溶解；若鱟試劑裝量大于0.1ml，則取若干支，按標(biāo)示量加入 BET水溶解，再取0.1ml分裝于標(biāo)準(zhǔn)玻璃試管（10mm×75mm），將試管按如下形狀排列。
3）加樣：每列每支加入相應(yīng)濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液各0.1ml，第五列加入BET水0.1ml。
反應(yīng)及結(jié)果判斷：加樣結(jié)束后用封口膜封口，輕振動(dòng)混勻，置37 ℃水浴中保溫60±2min，將每管拿出緩緩倒轉(zhuǎn)180°，凝膠不變形為“＋”，凝膠不能保持完整為“－”。
當(dāng)2.0λ四支管都為陽性，0.25λ四支管都為陰性時(shí)，試驗(yàn)成立，按下面底公式計(jì)算復(fù)核的靈敏度λc ：
λc＝lg-1(∑X/4)
（X:反應(yīng)終點(diǎn)濃度的對數(shù)值。）
當(dāng)0. 5λ≤λc ≤2.0λ時(shí)，鱟試劑靈敏度復(fù)核合格，檢測時(shí)仍以標(biāo)示靈敏度λ為準(zhǔn)。
樣品的干擾試驗(yàn)
注：當(dāng)進(jìn)行新藥的內(nèi)毒素檢查試驗(yàn)前，或無內(nèi)毒素檢查項(xiàng)的品種建立內(nèi)毒素檢查法時(shí)，須進(jìn)行干擾試驗(yàn)。（注：須三個(gè)批號以上的供試品，兩個(gè)以上鱟試劑廠家的試劑）
當(dāng)鱟試劑、供試品的處方、生產(chǎn)工藝改變或試驗(yàn)環(huán)境中發(fā)生了任何有可能影響試驗(yàn)結(jié)果的變化時(shí)，須重新進(jìn)行干擾試驗(yàn)。如：內(nèi)毒素檢查時(shí)，供試品陽性對照為陰性時(shí)。方法為通過比較鱟試劑與在水溶液中的內(nèi)毒素和供試品溶液中的內(nèi)毒素反應(yīng)的差異程度，來確定供試品在該濃度下是否對內(nèi)毒素檢查有干擾。
操作：用內(nèi)毒素檢查用水和供試品將同一支內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品分別制備一系列濃度的內(nèi)毒素溶液，詳見下表：
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編 號 |
內(nèi)毒素濃度/配制內(nèi)毒素的溶劑 |
稀釋用液 |
稀釋倍數(shù) |
所含內(nèi)毒素 的濃度 |
平行管數(shù) |
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A |
無/供試品溶液 |
－ |
－ |
－ |
2 |
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B |
2λ/供試品溶液 |
供試品溶液 |
1 |
2λ |
4 |
|
2 |
1λ |
4 |
|||
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4 |
0.5λ |
4 |
|||
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8 |
0.25λ |
4 |
|||
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C |
2λ/檢查用水 |
檢查用水 |
1 |
2λ |
4 |
|
2 |
1λ |
4 |
|||
|
4 |
0.5λ |
4 |
|||
|
8 |
0.25λ |
4 |
|||
|
D |
無/檢查用水 |
－ |
－ |
－ |
2 |
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A：供試品溶液 B：供試品陽性對照 C：陽性對照 D：陰性對照 |
結(jié)果判定：
當(dāng)供試品陰性對照A和陰性對照D都為陰性，并且系列溶液C的結(jié)果在鱟試劑靈敏度范圍內(nèi)時(shí)，試驗(yàn)方為有效。
分別計(jì)算用檢查用水制成的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值（ES）和用供試品溶液和稀釋液制成的內(nèi)毒素溶液的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值（Et）；
ES =lg-1(ΣXS/4) Et =lg-1(ΣXt/4)
當(dāng)ES在0.5λ～2λ(包括0.5λ和2λ)及Et在0.5ES～
2 ES（包括0.5 ES和2 ES）時(shí)，認(rèn)為供試品在該濃度下無干擾作用。
導(dǎo)致干擾的因素及解決方案：
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導(dǎo)致干擾的因素： |
排除干擾的方法： |
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pH值 |
稀釋 |
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抗凝因子 |
中和 |
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螯合劑 |
過濾 |
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葡聚糖 |
加熱 |
4.3.5.3樣品的細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)
細(xì)菌內(nèi)毒素限值L的確定
藥品、生物制品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值（L）除藥典有規(guī)定的，一般按以下公式確定： L＝K／M
K為人每千克體重每小時(shí)最大可接受的內(nèi)毒素劑量，以EU/(kg·h)表示，注射劑K= 5EU/(kg·h)，放射性藥品注射劑K= 2.5EU/(kg·h)，鞘內(nèi)用注射劑K= 0.2EU/(kg·h)；
M為人用每千克體重每小時(shí)的最大供試品劑量，以ml/(kg·h)、 mg/(kg·h)或U/(kg·h)表示，人均體重按60kg計(jì)算，人體表面積按1.62㎡計(jì)算。注射時(shí)間若不足1小時(shí)，按1小時(shí)計(jì)算。供試品每平方米體表面積劑量乘以0.027即可轉(zhuǎn)換為每千克體重劑量（M）
按人用劑量計(jì)算限值時(shí)，如遇特殊情況，可根據(jù)生產(chǎn)和臨床用藥實(shí)際情況做必要調(diào)整，但需說明理由。
限值確認(rèn)時(shí)要遵循從嚴(yán)原則，要考慮病人在疾病狀態(tài)的耐受力和可能存在的聯(lián)合用藥的情況。
2）供試品最大有效稀釋倍數(shù)的計(jì)算：
C·L
MVD＝
λ
λ：測試用鱟試劑靈敏度標(biāo)示值(EU/ml)。
L：供試品細(xì)菌內(nèi)毒素限值。
C：供試品濃度或供試品復(fù)溶后所得樣品濃度。
當(dāng)L單位為EU/ml（溶液）時(shí)，C的單位為1ml/ml；
當(dāng)L單位為EU/mg或者EU/u時(shí)（抗生素原料），C的單位為mg/ml或者u/ml。
3）供試品溶液稀釋：將供試品稀釋，稀釋倍數(shù)為MVD。
含2λ內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品的供試品溶液（PPC）的制備：
4）加樣：取鱟試劑8支，每支加入BET水0.1ml溶解。2支為樣品管，加入樣品液0.1ml；2支加入陰性對照管，加入BET水0.1ml；2支為陽性對照管，加入2 2λ濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.1ml；2支為樣品陽性管，加入0.1ml含2λ內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品的樣品溶液。
37±1℃水浴中保溫60±1min。
結(jié)果判斷：
陽性對照為陽性
陰性對照為陰性 試驗(yàn)結(jié)果成立
樣品陽性對照為陽性
2支樣品管均為陰性時(shí)，樣品符合規(guī)定；
2支樣品管均為陽性時(shí)，樣品不符合規(guī)定；
樣品管1支為陽性1支為陰性時(shí)，需復(fù)試。
復(fù)試時(shí)做4支樣品管，有1支為陽性則樣品不符合規(guī)定。
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結(jié)果判斷 |
樣品管 |
陰性對照 |
陽性對照 |
樣品陽性對照 |
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符合規(guī)定 |
－－ |
－－ |
＋＋ |
＋＋ |
|
不符合規(guī)定 |
＋＋ |
－－ |
＋＋ |
＋＋ |
|
需復(fù)試 |
＋－ |
－－ |
＋＋ |
＋＋ |
|
復(fù)試符合規(guī)定 |
－－－－ |
－－ |
＋＋ |
＋＋ |
|
復(fù)試不符合規(guī)定 |
＋－－－ |
－－ |
＋＋ |
＋＋ |
4.3.6內(nèi)毒素檢驗(yàn)的注意事項(xiàng)
1)溶解鱟試劑及混勻供試品和鱟試劑時(shí)，不要?jiǎng)×艺袷幈苊猱a(chǎn)生氣泡。
2)由于凝集反應(yīng)是不可逆的，所以在反應(yīng)過程中及觀察結(jié)果時(shí)應(yīng)注意不要使試管受到振動(dòng)，以免使凝膠破碎產(chǎn)生假陰性結(jié)果。
3)在進(jìn)行鱟試劑靈敏度復(fù)核、干擾實(shí)驗(yàn)和供試品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查時(shí)，各個(gè)實(shí)驗(yàn)中要求的對照應(yīng)同時(shí)進(jìn)行，并在實(shí)驗(yàn)有效的情況下才能進(jìn)行計(jì)算和判斷。
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綜述
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標(biāo)準(zhǔn)
